畢業論文引言

1 引言

核苷酸及其衍生物在食品、醫學、農業、化粧品、及生化試劑等領域具有十分廣泛的用途。尤其在我國核苷酸的需求量很大，但主要依靠進口，在這個方面缺口很大[1]。目前核苷酸的生產工藝不完善，利用酶解法生產核苷酸以及酶解工藝條件的研究，在國內報道的很少，國內吳莉莉等人曾利用雙酶法降解核酸，生產呈味核苷酸i+g[2]。楊斌等人也對利用酶解法生產呈味核苷酸的生產進行過論述，但是都未曾對酶解核酸的工藝條件進行過優化摸索工作。

目前，對於核苷酸三種主要生產方法相比較而言，酶解法成本低，同時可以生產四種產品，明顯優於其他兩種生產方法。對於酶解法利用的原料rna，可以從啤酒廢酵母中提取，解決了啤酒廠廢酵母的出路，做到了資源的再生和利用。再對提取rna的廢酵母考慮綜合利用，可以產生更大的經濟效益和社會效益。雖然酶解法生產四種核苷酸有很大的優越性，但是，該方法中存在着以下幾個主要問題:1、原料質量差。目前國內rna的純度在80%左右，溶解後存在大量的雜蛋白，降低了酶解率。並且由於雜蛋白的存在增加了分離的難度。2、生產的菌株水平低：利用桔青黴作為生產核酸酶p1的菌株，其生產的酶活僅為國外菌株的60%，對rna的酶解率僅為70-85%，國外酶解率可以達到85%-95%。3、離交分離收率低：一方面由於酶解不徹底，存在許多雜質如寡聚核苷酸等，增加了分離難度；另一方面由於分離材料的選擇性差，對5’-核苷酸的吸附容量小，不能高效的分離四種核苷酸。4、結晶技術不過關。

所以通過rna水解實驗的研究，對rna水解條件進一步優化，得出水解rna的最佳工藝，儘可能多的得到單核苷酸，應用在各個領域。

1.1 核糖核酸酶

1.1.1 概述

從20世紀60年代以來，核糖核酸酶作為一種模型蛋白被普遍用於分子生物學研究。核糖核酸酶（rnase）的全名為聚核苷-α-寡核苷酸轉移酶，是一類廣泛存在於動植物體內的水解核酸鏈中磷酸二酯鍵的酶。這些酶對核酸的作用是水解核苷酸殘基之間的磷酸二酯鍵，生成寡聚核苷酸或單核苷酸。rnase的主要生理功能是控制細胞內rna的種類與數量分佈，除參與核糖核酸轉錄後的剪切、修飾和降解等過程外，還與某些植物的自交不親和性、器官發生、宿主的防禦機制、控制腫瘤血管生成、殺滅腫瘤細胞及抑制病毒複製等有關[3]。

1.1.2 核糖核酸酶的分類

根據酶作用核酸分子部位的不同，可分為3’-磷酸二酯酶和5’-磷酸二酯酶。根據反應的最適ph不同分為酸性核糖核酸酶和鹼性核糖核酸酶。酸性核糖核酸酶主要存在於細胞的溶酶體中，水解所吞噬的異物中的rna；鹼性核糖核酸酶存在於胞液中，水解胞液中的rna。根據降解rna底物的不同一般分為3類：rnaseⅰ既能催化rna 水解，又可催化dna水解，產生5’-單核低聚核糖核苷酸或5’-單核低聚脱氧核糖核苷酸；rnaseⅱ僅使rna釋放2’、3’環狀嘌呤核糖核苷酸和3’-嘌呤核糖核苷酸；rnaseⅲ只水解rna釋放2’、3’環狀嘌呤或嘧啶核糖核苷酸和3’-嘌呤或嘧啶核糖核苷酸。根據酶作用的專一性[2]可分為核酸外切酶①蛇毒磷酸二酯酶：從毒蛇的毒液中提取的，它從核酸的單鏈的3’-oh端開始水解，生成5’-單核苷酸，該酶的最適ph為9，ca2+和mg2+為激活劑，還原劑和螯合劑抑制酶活力；②脾磷酸二酯酶：從牛脾中提取的，水解產物為3’-單核苷酸。核酸內切酶：核酸酶s1從米麴黴菌中提取出來的單鏈專一性內切酶，產生5’-單核苷酸，最適ph為4.5-5.0，需要zn2+、co2+也可刺激酶活力，但mg2+、ca2+、cu2+無效。該酶對熱較穩定，底物存在時於65℃保温不失活。內切兼外切酶：核酸酶p1從桔青黴製得的，故又稱桔青5’-磷酸二酯酶，純化的p1酶對單鏈專一；最適温度70℃，最適ph5；zn2+為激活劑。8mol/l的尿素和5mol/l的鹽酸胍可抑制酶的活性。核酸酶p1酶還具有3’-磷酸單酯酶的活性，可水解3’-單核苷酸、核苷二磷酸、和3’-二核苷酸的3’磷酸鍵，核酸酶p1酶常常用於製備5’-單核苷酸。

1.1.3 核糖核酸酶的結構性質

核糖核酸酶的二級結構含有兩個獨立的摺疊結構域。每個結構域由一個內部的環區及其兩側的螺旋區組成。a環和b環含有高度保守的核苷酸序列，底物的切割位點在a環內。4個螺旋區的核苷酸序列可以有很大變化，其中a結構域的兩個螺旋區h1和h2是與底物特異性結合的部位。a、b兩個摺疊結構域通過三級結構相互作用形成一個功能複合體。二價金屬離子能夠促進功能域相互作用。最近發現，惰性過渡元素鈷的三價金屬離子絡合物co (nh3)63+及一些一價金屬離子也能起到二價鎂離子的作用。但一價金屬離子不如鎂離子有效，而且對鎂離子有拮抗作用。但對co(nh3)63+卻有協同作用。ph值對髮夾狀核糖核酸酶的反應速率影響很小，因此，金屬離子不可能是因為結合了oh2而起到一般鹼的催化作用。此外，切割位點的硫代磷酸修飾並不能抑制酶的活性，提示髮夾狀核糖核酸酶的催化機制與其它核糖核酸酶不同。由於核糖核酸酶種類的不同，其水解的rna、水解量、水解機理各不相同，所以表現出各種不同的性質。但主要性質也可歸納：①酶的熱穩定性：55℃以下酶活力基本穩定，65℃大約有50%活力損失，該酶為鋅酶，在酶液中補充鋅離子可以提高酶的熱穩定性。②zn2+濃度對酶熱穩定性影響：酶液中加入不同濃度zn2+，70℃熱處理20min，可以激活或強化5’-磷酸二酯酶的活性。③温度對酶活性的影響：70℃左右時酶的活力最高，温度升高或降低，酶活力下降。④酶的ph穩定性：酶液穩定的範圍在ph5.0-ph8.0之間。⑤ph對酶活性的影響：除反應分別在醋酸緩衝液的各種ph條件下進行外,均按測酶活方法進行。ph值在5.0-6.0時酶的活力最高[3]。

1.1.4 核糖核酸酶的應用

大規模生產5’-核苷酸是的核糖核酸酶主要用途之一。5’-核苷酸是動植物性食物味道的基本成分，尤其是其中的鳥苷一磷酸(gmp)和肌苷一磷酸(imp)，它們在大於或等於其域值時，呈現一種自身獨特的美味；在其域值以下時，也可以增加其它食品的鮮味。以往作為食品鮮味添加劑的5’-核苷酸主要是從酵母浸出液的部分水解物得到的，但是這種途徑生產5’-核苷酸的產量比較低(最大為6%)。而使用核糖核酸酶則可以把酵母浸出液生產5’-核苷酸的產量提高到20%左右。近年來對桔青黴等微生物所生產的核酸酶p1的毒理研究逐步深入，如ock等人對核酸酶p1所導致的毒性和突變性研究揭示核酸酶對小白鼠沒有毒性和致突變性，預測很快可以直接將微生物發酵生產的核酸酶p1用作食品添加劑。

1.2 核糖核酸酶的製備

工業上水解核酸用的核糖核酸酶多為從麥芽根中提取的核糖核酸酶，以及由桔青黴發酵得到的核酸酶p1。這兩種制酶的方法制得的酶就酶活來説，發酵液酶活較麥芽根中提取的要高，但發酵法生產酶的成本比從麥芽根中提取酶的成本高。

1.2.1 從麥芽根中提取核酸酶

麥芽根是麥芽生產啤酒過程中的主要副產物，目前一般只用作飼料，但近年來隨着研究的深入，發現麥芽根中不但蛋白含量高而且氨基酸組成合理。麥芽根佔大麥總投量的3%，由於我國啤酒生產規模較大，麥芽根的數量相當可觀。從麥芽根中提取5’-磷酸二酯酶的方法簡單易行且含量豐富，所以常用從麥芽根中製得的核酸酶來水解核酸。w.f iers等的研究發現，採用幹磨法粉碎的麥芽根，在ph2-8.5範圍內，用水進行提取，ph對酶提取率影響極小，而提高離子強度，則能顯著提高得率，得率提高數倍。在麥芽根的組成中，蛋白含量約為25%-35%，因此，蛋白質提取率不足30%。從蛋白質提取率來看，酶的提取尚有潛力。事實上，如何充分地將酶提取出來成為利用麥芽根核酸酶的一個首要問題，也是麥芽根利用經濟性的重要前提。

通常採用一定離子強度的水從麥芽根中提取核酸酶，這有利於麥芽根中酶的溶出。溶出的酶為多種酶的雜酶液，由於核酸酶在zn2+存在的條件下熱穩定性高，所以在雜酶液中加入zn2+，在70℃恆温水浴20min滅去雜酶，從而得到比較純的核酸酶液。通過紫外分光光度法測得酶活。

主要流程如下：

麥芽根→粉碎→過篩→加水→調ph→加離子→恆温水浴→加znso4→滅雜酶→酶液

1.2.2 從桔青黴發酵得到核酸酶p1

核酸酶p1的生產方法主要有3種：固體發酵法、深層液態發酵法以及固定化液體發酵法。固體發酵( solid2statefermentation，ssf)操作簡單，成本低，利用麩皮等農作物為原料，也能夠得到較高酶活的粗酶液。但是由於這些農產品成分非常複雜，因而，要想獲得純的核酸酶p1較為困難和繁瑣。

深層液態發酵法利用現代發酵技術，通過裝在發酵罐中的各種感應器，可以較好的控制發酵過程，其原料的配比也比較明確。通常的液體發酵主要工藝條件為：合成液體培養基，通風1∶0.4，發酵温度30℃，培養時間為50～70 h。不同生產廠家的工藝條件依據本身使用的菌種和設備有所調整。總體來説，液態發酵的菌絲體和發酵液較易分離，用於核苷酸發酵中。

近年來固定化液體發酵法在國外快速發展，將菌絲體固定在谷梗或其他一些惰性的材料上，重複使用，既提高了細胞的利用率和生物反應速率，也便於產物的分離。特別是利用某些惰性材料作為載體，可以在保持酶活的同時，簡化發酵液的成分，便於核酸酶的提取和純化。yang zhu等人研究了聚亞安酯惰性載體液體發酵生產核酸酶p1，並對惰性載體發酵條件進行了優化，結果表明酶產率比深層發酵提高4～20倍。

液體培養的流程：斜面培養→種子培養→發酵罐→酶液

固體培養的流程：斜面培養→種子培養→曲盤培養→浸取酶液

1.3 核糖核酸酶水解rna

核糖核酸酶水解核酸生成核苷酸，核酸降解產物的多少與核糖核酸酶的反應條件密切相關。水解反應只要在核糖核酸酶最適條件處反應水解核酸，得到的核苷酸的量就比較高。由於酶的不同核糖核酸酶的最適反應條件有所不同，一般來講發酵酶液的最適條件為(1)最適反應温度：一般在70℃左右；(2) 最適反應時間：2小時左右；(3)最適反應ph值：5.0~5.5；(4)最適底物濃度：rna的濃度為2%左右；(5)最適酶活：每克rna需要4000u。而由麥芽根提得的酶最適作用條件為(1)最適反應温度：一般在67℃左右；(2) 最適反應時間：2小時左右；(3)最適反應ph值：5.5~6.0；(4)最適底物濃度：rna的濃度為2%左右；(5)最適酶活：每克rna需要3000u。根據最適反應條件設計實驗。已知了核酸酶反應的各個最適條件，由於核酸酶的不同，核酸酶在水解核酸時的條件也不相同，所以在已知核糖核酸酶的大體反應條件的情況下，在各條件的附近設計不同水平的正交實驗方案。根據不同因素不同水平選用不同的正交實驗表，應用正交實驗表上的各因素的組合進行實驗得出數據，作出各因素的曲線圖，若不能確定該因素的最適水平，再繼續作未得出結果因素的正交實驗，直到得出最適條件。將水解產物加沉澱劑沉澱離心，取上清液，用紫外分光光度計法測260nm處的紫外吸收值。同時用發酵得到的酶液進行正交實驗設計，方法與提取酶液水解方法相同。

1.4 核苷酸的結構性質與檢測

1.4.1 核苷酸的結構性質

核苷酸是核酸的組成單位，它由三部分組成，分別為磷酸、戊糖和鹼基。核苷酸按戊糖的種類不同，可以分為核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸兩種，其中核糖核苷酸是rna的組成單位，而脱氧核糖核苷酸則是dna的組成單位。組成rna的核糖核苷酸按照核苷酸分子鹼基的不同，核苷酸可以分成四種，即5’-腺嘌呤核苷酸（amp）、5’-鳥嘌呤核苷酸(gmp)，5’-胞嘧啶核苷酸(cmp)和5’-尿嘧啶核苷酸(ump)。

5’-腺嘌呤核苷酸（5’-amp）分子量347.22，自丙酮水溶液中可得含有兩分子水的結品。溶於熱水，pk3.8(鹼性基團)<1，6.2-6.4(磷酸根)。

5’-鳥嘌呤核苷酸（5’-gmp:）分子量363.23，含1/2分子水的結品，pk2.4(鹼性基團)、9.4(酸性基團)<1，6.1(磷酸根)。熔點190-200℃(分解)。

5’-尿嘧啶核苷酸（5’-ump）分子量324.18，pk9.5(鹼基上酸性基團) <1，6.4(磷酸根)。

5’-胞嘧啶核苷酸（5’-cmp)分子量323.21，熔點233℃(分解)。pk4.5(鹼性基團)<1，6.3(磷酸根)。

四種核苷酸的結構式如下圖所示：

實際使用中，四種核苷酸主要以鈉鹽形式存在。其形態均為無色至自色結晶或白色結晶性粉末，在保藏和應用中多為核苷酸的二鈉鹽。

1.4.2 核苷酸的檢測

核酸水解產物核苷酸、核苷和鹼基的分析方法，主要有光譜法（紫外光吸收法）、質譜法、色譜法（高效液相色譜法、離子色譜、反相高效液相色譜（rp-hplc）、薄層色譜）、電泳法（毛細管電泳）等。其中毛細管電泳和高效液相色譜法的分離能力最強，在細胞分離方面有廣泛的用途，尤其是高效液相色譜法（hlpc）應用很多，紫外光吸收法應用方便，但準確率不高。離子交換液相色譜法具有較高的分離效率，但是需要對分離柱進行再生，分析的時間較長；反相液相色譜法具有快速、操作方便的特點，現有離子對反相和常規反相色譜，洗脱方法可採用等度洗脱，也可採用梯度洗脱。目前有許多關於核苷酸檢測這方面的報道：張志國，賈雲虹等用hplc和紫外檢測方法對乳粉中的四種核苷酸cmp、ump、amp、gmp含量進行了檢測，採用c-18柱，據報道結果完全符合要求。吉瓊梅等人用0.05mol/l的kh2po4為流動相的高效液相色譜法測定了棉寶中的5’-amp、5’-cmp、5’-gmp、5’-ump的分解率。黃曉蘭、李科德和陳雲華報道採用反相高效液相色譜可以分離15種核酸的水解產物，並介紹了該方法在酵母抽提物中的應用。霍小敏、屠春燕等人用反規液相色譜和梯度洗脱模式對酵母rna降解的4中核苷酸進行了分離和檢測。鄭理、朱懷恩等人用紫外光吸收法對保健品中的核酸含量進行了測定[7]。鄒耀洪、曹學增等對以hplc（高效液相色譜）與lc/ms(質譜)複合定性蘑菇柄中的5’-核苷酸進行了報道。韓鳳梅、楊新等人對四種單核苷酸的毛細管區帶電泳分離分析進行了報道。

1.5 核苷酸的生產應用

1.5.1 核苷酸生產方法概況

目前已經有多種方法可生產核苷酸及其衍生物。歸納起來，主要有以下三種：化學合成法、微生物發酵法及提取法。三種方法生產的工藝及產品均有很大的差別。

化學合成法

主要是利用核苷進行磷酸酯化反應，在要得到的核苷的5’-位上導入磷酸基而得到目的核苷酸。常用的磷酸化試劑為磷酸或者焦磷酸的活性衍生物，工業上多用三氯氧化磷。目前化學法合成核苷酸的收率為85%左右。化學法合成法按照反應條件不同可以再細分為：ott法、ludwig法、其它方法。化學合成核苷酸的方法由於所用的試劑較貴、有毒性，生產成本比較高，僅用於一些特殊用途的5’-核苷酸及其衍生物的合成，目前僅用在實驗室規模。

微生物發酵法生產5’-核苷酸

微生物發酵法生產5’-核苷酸目前已有生產規模，但不是所有的5’-核苷酸都可以用微生物發酵法來生產，目前只有幾種核苷酸可行。

肌苷的生產工業流程:斜面→種子→種子罐培養→發酵→發酵液調ph→陽性樹脂吸附→水洗→活性碳吸附→鹼洗脱→一次濃縮→過濾→二次濃縮→冷凍結晶→抽濾→乾燥→精製→肌苷成品

鳥苷酸(gmp)的生產原理：鳥苷酸和腺苷酸都是嘌呤核苷酸生物合成的終產物，鳥苷酸在菌體內的濃度超過一定限度，就會引起反饋調節，抑制鳥苷酸自身的合成。同時，鳥苷的溶解度很低，在發酵時容易析出結晶，也可以減弱反饋調節作用，積累鳥苷。

提取法

在菌體內rna含量的變化受培養基組成影響。通常細菌中含rna5%～25%，酵母中含2.7%～15%，黴菌含0.7%～28%，麪包酵母含rna4.1%～7.2%。其中由於酵母體內的rna/dna含量最高，且培養酵母菌體的收率高，並且生產上存在大量廢酵母，故目前多用酵母菌體來提取核苷酸。

1.5.2 核苷酸的應用

核苷酸的功能

核苷酸在生物體內具有多種生物學功能，在維持細胞能量調節等方面有着重要的作用。在體內，作為核酸的基本組成單位，核苷酸的多少直接影響細胞rna和dna的合成水平，從而影響到機體的各種生理功能。核苷酸具有免疫調節功能，核苷酸對機體的肝臟、小腸等器官組織也有很明顯的影響，對於肝部有疾病的人來講，補充核苷酸是有力的，有實驗證實了對於象腸胃道這樣增生較快的組織，提高體內核苷酸水平有利於這些組織的正常發育、成熟和修補。在生物體內，核苷酸存在於所有細胞中，它們可以作為機體的能量來源，作為激活糖原和糖蛋白合成的重要中介物、磷脂合成的重要中介物，作為甲基和硫酸鹽的供體，是各種代謝途徑起關鍵作用的輔酶的重要組成成分，作為變構效應因子可以控制體內許多重要代謝途徑的調節步驟，是機體生命活動的基礎。

核苷酸的用途

核酸類物質已用於各種醫療方面，作為重要的醫藥中間體，核糖核酸降解後得到的核苷酸、核苷及鹼基都是用途廣泛的藥物，它們的衍生物在抗腫瘤和抗病毒方面的應用則更為顯著。腺苷、肌苷、尿苷、核苷酸、脱氧核苷酸、胞二磷膽鹼、核苷三磷酸等核酸的有關組分及衍生物，是天然的代謝激活劑，有助於改善機體的物質代謝和能量代謝，加速受損組織的修復，促使病態細胞、缺氧組織恢復正常生理功能。腺苷酸是體內能量傳遞物質，比腺三磷穩定，具有顯著的擴張血管和降壓作用，適用於肝病、瘙癢、靜脈曲張性潰瘍併發症。天然的黃嘌呤類似物有興奮中樞神經系統的作用，其作用的主要部位是大腦。5’-氟尿嘧啶為尿嘧啶抗代謝物，在體內轉變成5’-氟-2’-脱氧尿嘧啶核苷酸，抑止胸腺嘧啶脱氧核苷酸合成酶，阻斷脱氧尿嘧啶核苷酸轉變成為胸腺嘧啶脱氧核苷酸，從而影響dna的生物合成，抑制腫瘤細胞的生長增殖[5]。

5’-gmp和5’-imp與味精調合使用具有顯著的鮮味相乘效應，且風味更佳，還可與經過特殊工藝加工的動物蛋白和植物蛋白及多種氨基酸混合，調配各種風味的特鮮味精等調味品，因此利用微生物發酵法生產核苷和核苷酸的主要應用領域是在食品工業中作為風味強化劑。歐洲已經發表有關添加nt奶粉指導方針，歐洲、美國、日本、韓國等市場已銷售添加核酸和nt的奶粉。母乳內含有較多的核酸，而原來普通奶粉大多數不含核酸。嬰兒飲用奶粉常常會有先天過敏症，而且對抗感染能力也較弱，主要原因是奶粉中缺少核酸之故。為了使以牛奶為基礎的代乳品更加接近人乳，將核苷酸添加到以牛奶為基礎的代乳品中，對嬰幼兒的胃腸道發育、胃腸道健康的維持以及血漿脂蛋白的組成都有有利的影響[6]。核苷酸通過改善每一細胞的活力而提高機體各系統的自身功能和自我調節能力，來達到最佳綜合狀態和生理平衡，因此具有廣泛而穩定的營養保健作用。核苷酸添加於保健品中，對促進兒童的生長髮育，增強智力，提高成年人的抗病抗衰老能力及手術病人的身體康復均有顯著作用，特別對老年人效果更佳。

1.6 本文的研究目的和內容

從以上的綜述中可以看到，核苷酸作為基礎性原料，應用領域很廣。尤其是在醫藥行業上，除了自身可以作為藥物使用外，還是合成許多新型抗病毒、抗腫瘤、抗癌藥物的原料。新的核苷酸的相關衍生物也不斷湧現，這些藥物有望成為解決目前一些疑難雜症的新型藥物。因此徹底解決核苷酸的大規模生產問題，解決這一基礎性原料的短缺顯得尤為重要。

1.6.1 本文研究的目的

雖然酶解法生產四種核苷酸有很大的優越性，但是，該方法中存在着原料質量差、酶活底、酶解不徹底等問題。針對上述問題本文研究的目的是如何從rna中水解得到更多的核苷酸，以及如何從麥芽根中提取更多的酶。主要有：1，研究從麥芽根中提取核酸酶最佳的提取條件，更多的從麥芽根中提取核酸酶。2，研究水解rna最佳的水解條件，儘可能提高水解後核苷酸的量。

1.6.2 本文的主要內容

麥芽根中核酸酶的提取

① 研究在不同加水比、ph值、温度、時間等條件下酶的活力大小。

② 酶活的測定，採用紫外分光光度計法。

水解rna條件的研究

① 用從麥芽根中提取的核酸酶水解rna，研究不同底物濃度、加酶量、ph值、温度、時間等條件下水解率的高低。

② 用發酵酶液水解rna，研究不同因素水平下水解率的高低。